مقدمه
فناوری توالییابی نسل جدید (NGS) طی دو دهه اخیر به یکی از مهمترین ابزارهای زیستشناسی مولکولی، ژنتیک و پزشکی دقیق تبدیل شده است. با گسترش کاربردهای NGS در تشخیص بیماریها، مطالعات سرطان، فارماکوژنومیکس و تحقیقات ژنومی، شرکتهای مختلف فناوریهای متنوعی را برای توالییابی DNA و RNA توسعه دادهاند.
اگرچه هدف تمام این پلتفرمها تعیین توالی مولکولهای ژنتیکی است، اما هر یک از آنها از فناوری متفاوتی استفاده میکنند و از نظر طول خوانش، دقت، سرعت، هزینه و کاربردهای بالینی با یکدیگر تفاوت دارند. انتخاب پلتفرم مناسب به نوع پروژه، حجم داده مورد نیاز و اهداف تحقیقاتی یا تشخیصی بستگی دارد.
Illumina؛ پرکاربردترین پلتفرم NGS جهان
بدون شک Illumina شناختهشدهترین و پرکاربردترین پلتفرم توالییابی نسل جدید در جهان است. این فناوری بر پایه Sequencing by Synthesis (SBS) یا توالییابی از طریق سنتز عمل میکند و از نوکلئوتیدهای فلورسنت برای شناسایی بازهای DNA استفاده میکند.
دقت بسیار بالا، هزینه مناسب به ازای هر باز و توانایی تولید حجم عظیمی از دادهها باعث شده Illumina به انتخاب اول بسیاری از مراکز تحقیقاتی و آزمایشگاههای تشخیصی تبدیل شود. امروزه بخش بزرگی از پروژههای توالییابی ژنوم، اگزوم، RNA-Seq و مطالعات سرطان با استفاده از این پلتفرم انجام میشود.
مزایا
- دقت بسیار بالا
- هزینه پایین به ازای هر باز
- پشتیبانی گسترده نرمافزاری و تحلیلی
- مناسب برای پروژههای با حجم داده بالا
محدودیتها
- تولید خوانشهای کوتاه
- نیاز به زیرساخت محاسباتی مناسب
Ion Torrent؛ توالییابی مبتنی بر نیمهرسانا
Ion Torrent رویکرد متفاوتی نسبت به سایر سیستمهای NGS دارد. این فناوری به جای استفاده از سیگنالهای نوری، یونهای هیدروژن آزاد شده در هنگام سنتز DNA را شناسایی میکند و آنها را به سیگنال الکتریکی تبدیل میکند.
سرعت بالا، سادگی فناوری و زمان کوتاه آمادهسازی نتایج از مهمترین مزایای این پلتفرم محسوب میشود. به همین دلیل Ion Torrent در بسیاری از آزمایشگاههای تشخیص مولکولی و مراکز پزشکی دقیق مورد استفاده قرار میگیرد. اما یکی از چالشهای این روش، نواحی دارای تکرارهای طولانی DNA است که میتواند دقت نتایج را تحت تأثیر قرار دهد.
در سرطانشناسی، Ion Torrent برای شناسایی جهشهای مرتبط با انواع سرطان و انتخاب درمانهای هدفمند مورد استفاده قرار میگیرد. علاوه بر این، در مطالعات بیماریهای عفونی، فارماکوژنومیکس، پزشکی شخصیسازیشده و تحقیقات ژنومی نیز کاربرد فراوانی دارد.
مزایا
- سرعت بالا
- عدم نیاز به سیستمهای نوری پیچیده
- زمان کوتاه آمادهسازی و تحلیل
محدودیتها
- خطا در نواحی Homopolymer
- دقت کمتر نسبت به برخی فناوریهای دیگر
Pacific Biosciences (PacBio)؛ پیشگام خوانشهای بلند
یکی از محدودیتهای بسیاری از فناوریهای NGS، تولید خوانشهای کوتاه است. شرکت Pacific Biosciences (PacBio) با معرفی فناوری Single Molecule Real-Time Sequencing (SMRT) این مشکل را تا حد زیادی برطرف کرده است.
PacBio قادر است قطعات بسیار طولانی DNA را در یک خوانش تعیین توالی کند. این ویژگی امکان مطالعه نواحی پیچیده ژنوم، تغییرات ساختاری و مونتاژ ژنومهای جدید را فراهم میکند. نسل جدید سیستمهای HiFi Sequencing علاوه بر طول خوانش زیاد، دقت بسیار بالایی نیز ارائه میدهند.
مزایا
- خوانشهای بسیار بلند
- دقت بالای HiFi Reads
- مناسب برای مونتاژ ژنوم و تحلیل تغییرات ساختاری
محدودیتها
- هزینه بالاتر نسبت به فناوریهای Short-read
- توان عملیاتی کمتر در برخی کاربردها
Oxford Nanopore؛ نسل جدید توالییابی مستقیم
Oxford Nanopore Technologies (ONT) یکی از نوآورانهترین فناوریهای توالییابی محسوب میشود. در این روش، مولکول DNA یا RNA از میان نانوحفرههای پروتئینی عبور میکند و تغییرات جریان الکتریکی برای تعیین توالی مورد استفاده قرار میگیرد.
بزرگترین مزیت این فناوری، امکان تولید خوانشهای بسیار بلند و حتی توالییابی مستقیم RNA است. همچنین برخی دستگاههای این شرکت به اندازه یک حافظه USB هستند و قابلیت استفاده در محیطهای خارج از آزمایشگاه را دارند. این ویژگیها Oxford Nanopore را به گزینهای جذاب برای تحقیقات میدانی، اپیدمیولوژی و مطالعات ژنومی پیشرفته تبدیل کرده است.
مزایا
- خوانشهای فوقالعاده بلند
- توالییابی مستقیم RNA
- دستگاههای قابل حمل
- امکان تحلیل بلادرنگ دادهها
محدودیتها
- دقت خام پایینتر نسبت به Illumina
- نیاز به پردازش و اصلاح خطا
مقایسه کلی پلتفرمها
| پلتفرم | طول خوانش | دقت | سرعت | کاربرد اصلی |
|---|---|---|---|---|
| Illumina | کوتاه | بسیار بالا | بالا | ژنوم، اگزوم، RNA-Seq |
| Ion Torrent | کوتاه | بالا | بسیار بالا | تشخیص مولکولی و سرطان |
| PacBio | بلند | بسیار بالا (HiFi) | متوسط | مونتاژ ژنوم و تغییرات ساختاری |
| Oxford Nanopore | بسیار بلند | متوسط تا بالا | بالا | Long-read و توالییابی مستقیم |
کدام پلتفرم برای پزشکی دقیق مناسبتر است؟
در کاربردهای بالینی و تشخیص مولکولی، Illumina و Ion Torrent همچنان بیشترین استفاده را دارند. دقت بالا، وجود پنلهای تشخیصی استاندارد و زیرساختهای گسترده تحلیل داده، این دو پلتفرم را به گزینههای اصلی آزمایشگاههای پزشکی تبدیل کرده است.
در مقابل، PacBio و Oxford Nanopore بیشتر در پروژههای تحقیقاتی پیشرفته، تحلیل ساختارهای پیچیده ژنومی و مطالعاتی که به خوانشهای بلند نیاز دارند، مورد استفاده قرار میگیرند.
جمعبندی
امروزه پلتفرمهای متعددی برای انجام توالییابی نسل جدید در دسترس هستند که هر کدام مزایا و محدودیتهای خاص خود را دارند.
- Illumina همچنان پرکاربردترین فناوری NGS در جهان محسوب میشود.
- Ion Torrent به دلیل سرعت بالا و سادگی استفاده جایگاه مهمی در تشخیص مولکولی دارد.
- PacBio با ارائه خوانشهای بلند و دقیق برای مطالعات ژنومی پیچیده مناسب است.
- Oxford Nanopore افقهای جدیدی را در توالییابی مستقیم و تحقیقات میدانی گشوده است.
انتخاب پلتفرم مناسب به اهداف پروژه، نوع نمونه، حجم داده مورد نیاز و کاربرد نهایی بستگی دارد. با پیشرفت مداوم فناوریهای توالییابی، انتظار میرود این ابزارها نقش پررنگتری در توسعه پزشکی دقیق، تشخیص زودهنگام بیماریها و درمانهای شخصیسازیشده ایفا کنند.
منابع
- Goodwin S, McPherson JD, McCombie WR. (2016). Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nature Reviews Genetics, 17(6), 333–351.
- Metzker ML. (2010). Sequencing technologies — the next generation. Nature Reviews Genetics, 11(1), 31–46.
- van Dijk EL, Auger H, Jaszczyszyn Y, Thermes C. (2014). Ten years of next-generation sequencing technology. Trends in Genetics, 30(9), 418–426.
- Logsdon GA, Vollger MR, Eichler EE. (2020). Long-read human genome sequencing and its applications. Nature Reviews Genetics, 21(10), 597–614.
- Heather JM, Chain B. (2016). The sequence of sequencers: The history of sequencing DNA. Genomics, 107(1), 1–8.